oxymona (oxymona) wrote,
oxymona
oxymona

Categories:

Как я встретил вашу ПЦР (длиннопост)

Запасайтесь чаем и печенюшками, рассказ будет для терпеливых :)
О полимеразной цепной реакции я узнала в первый раз на третьем курсе универа, когда писала свой курсак. Год это был мохнатый - 2006. У меня, собсно, и курсак-то был о новейших методах диагностики. Вот тогда-то я и узнала чёй это такое, ваша цепная реакция. Ну узнала - и узнала его как один из передовых методов в длинном списке ИФА, ПМР, ЯМР, ПИФ, ИХА и прочих трехбуквий. А потом, через год, загремела на практику в одну крутую по тем временам частную диагностическую лабораторию. Подозрваю, что она и сейчас не хуже отальных, но кричат о себе сейчас другие частники.
И в первый день нас, двух воробушек вели по длинному коридору, остро пахнущему дез средствами, запах которых теперь навсегда для меня будет ассоциироваться с летом, жарой, кондерами, стрессом и тонной пробок, которую мы накрутили за ту практику.
Вели нас, значит, по коридору и говорили: тут у нас клиничекий отдел, тут у нас отдел дисбактериозов, тут отдел урологичесикх инфекций, тут грибы растут, тут еще хрень какая-то с потолка свисает, средоварка, автоклавная и прочая клавная, там чувак пришибленный на стульчике сидит, тут тупик с пауками, тут барнакл щупальца развесил... А здесь (с трепетом в голосе) отдел ПЦР! И указывают нам, зеленым (от запаха дез средств конечно же) воробушкам, на закрытую дверь. Туда вам нельзя. Нельзя-нельзя. Нельзя не так, как в фильмах ужасов нельзя за страшную запертую красную дверь, потому что там гот в ПЦР-ной, а нельзя потому, что мы там все сломаем и потеряем. И я со священным трепетом смотрела на белую дверь с табличкой ПЦР и глазами поедала стеклянное окошко под потолком, словно оттуда можно было что-то разглядеть в той запретной комнате.
Это и было мое второе знакомтство с ПЦР. Огромная комната, разделенная на кучу помещений. Входить туда могут только специально обученные сотрудники, а нам, воробушкам, никогда-никогда не светит даже нос туда свой сунуть. Единственное, чем мы касались ПЦР, - это вставяли пинцетами наконечники в большие планшеты а после, отправляли их на стерилизацию. Попав сюда же на преддипломку на пятом курсе, на ту заветную дверь с табличкой ПЦР, я даже не смотрела. Тогда я зарубила себе на носу: ПЦР мне никогда не светит.

Так в жизни случается, что порой мне начинает светить и менно то, о чем я никогда и подумать не могла. И так случается, что те вещи, что раньше занимали несколько комнат и нуждались в особой чистоте помещений, теперь занимают уголок стола и вообще не требуют никакой чистоты. Ну, кроме самой банальной, типа смахивания пыли и спиртовой обработки деталей тонкопленочным методом...

Так уж случилось, что однажды заведующая созвала нас в клинике (в клиническом отделе, ибо там она и обитает) и сказала следующее: "Я пригласила вас, господа, с тем, чтобы сообщить вам пренеприятнейшее известие: к нам едет ПЦР!»

Было в этом что-то такое... пенеприятное для моих коллег. Наверное поэтому я все отмалчивалась в кулачок и ждала агрегата, как подарок под елку. Потому, что скажи я что-то типа "УРРРЯ! ТРЛРЛРЛР-ЯХХХУ!" меня бы не поняли. Все вокруг боялись страшной-ужасной махины со сложным названием и не менее сложным механизмом и думали, что уж этот каменный молот им не освоить. Поэтому я позволила себе только раз сказать спокойным уравновешенным тоном совершенно незаинтересованного человека (они вообще на работе считают меня очень спокойной) что-то типа "Разберемся" и больше об аппарате уже не упоминала.

Аппарат напомнил о себе сам, прибыв в один прекрасый день в огроменной коробке, которую еще и бросили на пол так, что там внутри что-то жалобно звякнуло. Аппарат достал и устинавливал квалифицированный коллега-микробиолог В от компании, занимающейся этой ерундятиной, и, так уж снова получилось, что мне одной было не пофиг на все это, поэтому информацию я получила из первых уст почти единолично. Зато провела несколько упоительных часов разгвоаривая с собой с умным человеком.

А теперь отбросим лирику и перейдем к фактам.
По утверждению представителя компании В, все началось 11 сентября 2001 года. Или после этого, когда особую моду обрел био-терроризм и стало очень сильно необходимо изобрести такой аппарат, который неконтактным образом мог определить наличие Бациллюс антрацис в конверте.
Почему я говорю, ссылаясь на слова В? Потому, что в литературе по этому делу не нашла подтверждений. Поэтому и утверждать с уверенностью человека с чистой совестью не могу. Это похоже на правду, поэтому кажется правдой.

Правда такая: с 1996 по 2010 год шли разработки аппатара для автоматичекой амплификации нуклеиновых кислот на картриджной основе именно для ТБ. Для туберкулеза.
И где-то в 11-м году это дело пустили на конвейер для внедрения в лаборатории. До нас он добрался в 2015. Правда, наша лаборатория стала пионером среди лабораторий нашего (среднего) уровня в использовании ПЦР аппарата для диагностики туберкулеза.

Итак, за пару лет наука шагнула от огромной комнаты до вот такого вот ящичка, чем не прогресс?
DSC_0001 (1)

Такие вот аппараты существуют в нескольких вариациях: на 1 отсек, 2 отсека, 4 отсека и на 16.
А точнее, бывают еще монстры, как этот, справа... Но он какой-то слишком рендерный :)
Снимок экрана 2016-01-26 в 20.09.17

Так как в век популяризации науки даже Википедия научилась удобоваримо обьяснять что такое ПЦР, сыпать терминами типа "репликативная вилка" "праймеры" "полимераза" я не буду... хотя нет - буду.

Аппарат GeneXpert используется для определения наличия в образце мокроты генетического материала микобактерии туберкулезного комплекса.
Все начинается в плевке. Прежде чем внести аналит (анализируемое вещество или мокроту) в картридж, его нужно подготовить. Мокроту (а чаще всего используется именно она) необходимо обработать. В простонародье - разжижить. Если бы речь шла о комплексном исследовании (типа того, что я описывала ранее - бактериоскопия, посев, Xpert), то к "разжижению" бы добавилась деконтаминация - осовбождение материала от прочих бактерий, кроме микобактерии. Однако, если анализ подразумевает исключительно ПЦР, то в деконтаминации проба не нуждается, т.к. в картридже находятся зонды только необходимых последовательностей - последовательностей гена proB, дикого штама микобактерии, ответственного за резистентность к рифампицину. Но об этом чуть позже.

Итак, мокроту нужно разжижить, а то ни один Xpert ее не всосет. Для этого компания и придумала масюсенькие порционные баночки с "буфером", как они его называют. В состав того буфера входит NaOH (едкий натр собственной персоной), легко и просто разбивающий любые слизистые тяжи в мокроте и какой-то загадочный спирт, ноу-хау которого они не открыли нашим неподготовленным умам. В каком месте это можно назвать "буфером", науке в лице меня не известно, но раз уж коллега В из компании, занимающейся производством сего чуда, так сказал, не мне спорить.
После добавления "буфера", мокрота очень быстро превращается в чистую-чистую прозрачную жидкость желтоватого (цвет буфера) цвета. Похоже, что там все-таки происходит и частичный лизис микобактерий, как утверждает коллега, но я сомневаюсь. Как мы знаем, микобактерии спирто-кислото-щелоче-устойчивые. Так что ваш натр, каким бы едким он ни был, ей ни по чем. Хотя вру, совсем уж едкий - съест все. Даже стол.
Вот теперь только подготовленный образец вносится в картридж и дальше начинается действо.

Когда коллега В достал картридж, я подумала "Шо?!" Ну не так мне виделись картриджи. Хотя это изобретение весьма даже оригинально.
Снимок экрана 2016-01-26 в 20.05.22

Картридж - самая важная часть всего процесса. То, что раньше занимало разные отделы, комнаты и зоны, теперь содержится под крышкой этой чудо-коробочки. Ну не Вах ли?! Вот именно!
Картридж внутри поделен на отсеки, в окторых находятся реактивы необходимые в разные моменты реакции.
Вот так он выглядит в разрезе.
Снимок экрана 2016-01-26 в 20.06.58
Через верхнюю синенькую крышку в картридж опускается поршень. Центральный отсек, который работает как коршень шприца, всасывает в себя необходимое кол-во аналита из емкости в которую мы ввели порцию обработанной мокроты. Внизу каждого отсека для картриджа находится поворотный столик, который поворачивает центральный отсек, открывая те или иные отверстия в другие отсеки с реагентами. Реагенты в виде бусинок удежрживаются в отсеках на определенном уровне и дожидаются каждый своего часа, своего оборота столика и движения поршнем.
Снимок экрана 2016-01-26 в 20.07.26

Что происходит первым делом? Первым делом, в наш аналит попадает гранула со спорами SPC- ноу хау для внутреннего контроля качества работы картриджа. Чокак? А так: если ДНК из спор амплифицировалось, значит с реагентами в картридже все ок. Без этого контроля результат недействителен.
После того, как в аналит попадают споры SPC, пршень пропускает жидкость через фильтр, на котором осаждаются микобактерии и споры. После этого происходит их ультразвуковое разружение. Клетки лизируются, выпуская генетический материал в жидкость. После этого, столик снова делает свой оборот, поршень впрыскивает аналит в отсек с прочими реганетами (праймерами, зондами, полимеразами и прочими -азами.)

Как мы знаем из Вики, ПЦР состоит из этапов:
1. Денатурация, или расплетение ДНК под действием весьма себе таких высоких температур. Яйцо на сковородке жарили? Тоже денатурация. Только в случае с ДНК, до состоянии яичницы ее не стоит доводить.
2. Отжиг - присоединение праймеров к комплиментарным участкам расплетенной цепи ДНК. Все это происходит при более пониженной температуре.
3. Элонгация. В дело вступает полимераза, которая достраивает на цепи ДНК комплиментарную цепь, используя праймер в качестве затравки. Процесс просиходит при определенной температуре.
Процесс происходит в несоклько циклов для накопления достаточного количества необходимых копий.

Копий чего?
А вот: есть такой ген proB, состоящий из 81 пары оснований в диком штамме МБТ отвечает за чувствительность к рифампицину. Это как? Это если ген такой, как в диком штамме, - чувствителен, если ген мутировал - устойчив.

В чем суть амплификации? В многократном образовании копий искомой последовательности. Распустили ДНК, реплицировали. Из одной получили 2. Распустили 2 - получили 4. Геометрическую прогрессию все знают.
Итак, у нас в аналите имеется некое кол-во искомой последовательности. Как ее отследить?

А вот! Для анализа используется пять зондов - на картинке PROBE A, B, C, D, E. Зонды комплиментарны пяти участкам дикого гена proB. Если какой-то участок мутировал - зонд не прицепистся на этот участок и покажет мутацию, т.е. устойчивость к рифампицину.
Снимок экрана 2016-01-26 в 20.18.48
Как это видно?
Зонд выглядтит вот так. На одном конце его некая флуоресцентная молекула, которая в нерабочем состоянии зонда инактивируется гасителем. Но если зонд уселся на ген, гаситель располагается на растоянии от флуоресцентной молекулы и та дает свечение при облучении светом (каким - опять же, не говорится)
Снимок экрана 2016-01-26 в 20.18.56
Аналит облучается в специальной реакционной пробирке. Пыптык сзади картриджа видели? Это и есть реакционная пробирка. Через нее пропускается обработанный аналит, который тут же и облучается. И тут же снимается уровень флуоресценции в течении 50 циклов амплификации.

Результаты мы видим на графике, который строится в реальном времени на протяжении этих 50 циклов. Где-то на 20-30 циклах флуоресценция зонда внутрненнего контроля SPC должна преодолеть порог и пойти в рост. Если этот желтенький график (SPC) не растет, занчит ПЦР не прошла, не зависимо от результата по анализируемым зондам.

Вот так выглядит положительный результат (кстати, еще не результат, т.к. не пройдено 50 циклов) с чувствительностью к рифампицину. Рост флуоресценции SPC, как обязательное условие, и рост всех 5 кривых зондов. Значит, штамм еще не мутировал.
Снимок экрана 2016-01-27 в 17.31.23

Вот так выглядит результат, а точнее процесс для пробы с устойчивой МБТ. При чем, по тому как рано выросли графики анализируемых зондов, можно судить о том, что искомых последовательностей в образце было дофига, простите за мой ненаучный язык. Мы видим рост 4 графиков исследуемых зондов и отсутствие роста пятого. Отсуствие роста флуоресценции любого из 5-ти исследуемых зондов свидетельсвует об устойчивости находящейся в образце МБТ к рифампицину.
Снимок экрана 2016-01-27 в 17.39.32

Этот медот не является количественным. Это качественный метод, который отвечает на 2 вопроса: есть ли МБТ в образце и есть ли устойчивость к рифампицину. То, что программа добавляет "от себя" еще одну характеристику - "низкий" "средний" "высокий" "очень высокий" - это тоже не количественный учет, а ее аппаратное субьективное мнение. :)

Пусть никто не заблуждается, что ПЦР является наиболее чувствительным методом и может определить наличие генетического материала в образце даже если его там полторы молекулы. Самым чувствительным до сих пор остается посев на плотную среду. Тут все просто: 50Х50 - либо вырастет, либо не вырастет :)))
Фишка не в том. ПЦР определяет наличие генетического материала в образце, а посев покажет жизнеспособные это палки, дохлые или вообще разрушенные.
Поэтому нашей новой лаборантке я уже второй день воспеваю первостепенную важность посева на питательные среды среди всех прочих методов.

А теперь для особо терпеливых я объясню почему нас интересует именно рифампицин. Дело в том, что рифампицин в коплексе с изониазидом - основные препараты 1 ряда. Первый ряд антибиотиков - более эффективен и менее токсичен, чем препараты второго ряда. А препараты второго ряда еще и более дорогостоящие. Но когда микобактерия приобретает устойчивость к преапаратам 1 ряда, не остается ничего иного, как назнавать препараты 2 ряда. Так почему риф и изониазид? Потому что устойчивость именно к этим двум антибиотиком называется мультирезистентностью. Помните "мультики" о которых я упоминала ранее? "Мультики" намного хуже поддаются лечению и для них курс растягиватется на 20 месяцев и больше. Процент ремиссий мультирезистентных форм намного ниже, чем у других форм. Так что мультирезистентность всем плоха, а анализ на GeneXpert сразу определяет устойчивость к одному из и наводит на некоторые мысли и корректировку в терапии вновь поступивших больных.

Как я уже говорила, целесообразным этот тест будет только для тех случаев, когда антибиотикотерапия еще не началась. Почему? Потому, что аппарат определяет наличие генетического материала в образце. А были то живые клетки, или дохлые - ПЦР не скажет, а только введет врача в заблуждение. Наши врачи, знаете ли, любят заблуждаться лишний раз.

Насколько он эффективен в череде методов диагностики? Как тест, подтверждающий наличие микобактерий в мокроте больного - да. Как дорогостоящий, но очень быстрый (меньше двух часов) метод определения устойчивости к рифампицину - может быть. Как чувствительный - возможно. Но он никогда не заметит дешевизну и скорость прямой бактериоскопии, хоть и более чувствителен. (При определенном методе окрашивания, бактериоскопия так же может показать жизнеспособные и мертвые микобактерии в образце, так что и тут ПЦР проигрывает.) Хотя бактериоскопия может дать ложноположительный результат, окрасив микобактерии нетуберкулезного комплекса в малиновый, чего никогда не случится с узко-специфичным ПЦР. И наконец, никогда-никогда ПЦР не заменит посев и ТМЧ (тест на медикаментозную устойчивость к препаратам как 1, так и 2 ряда).
Он стоит дорого, он не очень информативен, однако прост и быстр, что в ранней диагностике туберкулеза весьма важно. ПЦР на данный момент является условно рекомендованным, но не категоричным. Его можно использовать как диагностический метод, но только в комплексе со всеми остальными. И главными методами остаются бактериоскопия, посев на плотную среду и ТМЧ. Медленные, печальные, но зато всесторонне информативные, а значит, от них не отвертеться. Это мой приговор :)

Вот такой вот неоднозначный метод поселился в нашем сарайчике.
Спасибо всем, кто вытерпел до конца.
Tags: xpert, ПЦР, Работа
Subscribe
  • Post a new comment

    Error

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

    When you submit the form an invisible reCAPTCHA check will be performed.
    You must follow the Privacy Policy and Google Terms of use.
  • 7 comments